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环状RNA cSMARCA5在肝癌中抑制癌细胞的生长和转移

2018-05-02

环状RNA cSMARCA5在肝癌中抑制癌细胞的生长和转移

Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma

期刊:Journal Of Hepatology

影响因子:12.486

作者单位:第二军医院


背景和目的:近年来,环状RNA(circRNAs)被发现在肿瘤生物学中发挥着重要的调控作用。然而,环状RNA在肝癌(HCC)中发挥的作用在很大程度上依然未知。


方法:cSMARCA5(一个产生于SMARCA5基因15号和16号外显子的环状RNA,hsa_circ_0001445)通过RNA测序识别,并被qRT-PCR(定量实时PCR)证实。 cSMARCA5在HCC中的作用通过体内和体外实验进行评估,包括circRIP(环状RNA体内沉淀实验)、荧光素报告基因测定实验、生物素偶联microRNA捕获实验和FISH(荧光原位杂交实验)等去评估cSMARCA5与miR-17-3p/miR-181b-5p之间的相互作用。


结果:DHX9(DExH-Box Helicase 9)是高丰度的核RNA螺旋酶,在HCC中,由于DHX9的上调表达,cSMARCA5的表达下降。在肝癌组织中,cSMARCA5的下调与侵袭性特征显着相关,并且是肝癌切除术后肝癌患者总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)的独立危险因素。体内和体外实验表明,cSMARCA5抑制肝癌细胞的增殖和迁移。从机制上看,作者发现cSMARCA5通过吸附miR-17-3p和miR-181b-5p来促进TIMP3(一种肿瘤抑制因子)的表达。


结论:这些结果揭示了cSMARCA5在HCC生长和转移中的重要作用,并为肝癌研究进展中的circRNA作用提供了新的视角。


总结:cSMARCA5是一种环状RNA,抑制HCC的生长和转移,有望成为HCC的潜在治疗靶点。


01

通过RNA测序,在人肝组织中识别环状RNA

抽取肝癌组织(HCC)、周边组织(ANL)及健康肝组织RNA,建立环状RNA文库并进行测序,发现有4727个circRNAs,其中4214个circRNAs(89.15%)已经在circBase得到识别(图1-A);进一步发现,4142个circRNAs来源自2322个基因的外显子(图1-B),这些circRNAs的长度大部分小于1000 nt(图1-C)。对比HCC文库及ANL文库可知,这些识别到的circRNAs中有236个circRNAs有差异表达,其中包括108个在HCC中上调表达,128个存在下调表达(图1-D),部分circRNAs的差异表达情况通过qRT-PCR得到鉴定(图1-E)


图1


02

cSMARCA5在HCC中的特征

 作者选取了cSMARCA5进行研究,这个circRNA来源于SMARCA5基因的15号和16号外显子(图1-A)。该circRNA在HCC和ANL中差异表达的表达丰度最高(图1-B),它在HCC表达下调,但是其基因来源SMARCA5的pSMARCA5、mSMARCA5及蛋白的表达均上调,这暗示了,在HCC中下调表达的cSMARCA5不仅是剪接副产物,很可能发挥着功能。为了研究cSMARCA5的特征,通过随机引物和寡聚脱氧胸腺嘧啶RNA反转实验及RNaseR处理检测发现,cSMARCA5为不含poly-A尾巴的环状RNA(图2-C,D);另外,半衰期结果表明了cSMARCA5比mSMARCA5更稳定(图2-E),并主要在细胞质中表达(图2-F,G)。综上所述,cSMARCA5为稳定的环状RNA,在HCC中有明显的差异表达。


 图2


03

在HCC中,cSMARCA5的表达受到DHX9的调控

作者对cSMARCA5结构进行研究,发现SMARCA5的14号内含子和16号内含子有高度反向互补序列,为了验证这两端序列(I14RC和I16RC)是否促进cSMARCA5生成,作者分别构建cSMARCA5野生型载体(从SMARCA5基因的14号内含子到16号内含子)及两端片段截断载体,如图3-A,发现只有野生型载体能高表达cSMARCA5(图3-B),这说明了I14RC和I16RC不可或缺。

对RNA结合蛋白相关基因进行敲除发现,DHX9敲除后,cSMARCA5上调表达,但对pSMARCA5、mSMARCA5不受影响(图3-D)。而对敲除了DHX9的细胞分别过表达DHX9及其螺旋酶功能突变基因,过表达野生型DHX9的转化体中cSMARCA5表达水平重新受到调控,而功能突变的转化体中cSMARCA5不受影响,说明了DHX9对cSMARCA5的调控依赖其螺旋酶活性(图3-E)。同时,进行DHX9的RNA免疫沉淀,发现I14RC和I16RC被明显富集(图3-F)。此外,对HCC中的DHX9表达分析表明,DHX9在HCC中上调表达(图3-G,H),并在HCC组织中与cSMARCA5的表达负相关(图3-I)。


图3


04

cSMARCA5的下调表达预测肝切除术后HCC患者的临床病理学特征和不良预后

Kaplan-Meier生存曲线显示,cSMARCA5表达较低的HCC患者总生存率(OS,P = 0.0004)和无复发生存率(RFS,P = 0.0008)较差(图4-A,B)。cSMARCA5表达水平与甲胎蛋白、肿瘤大小、病理卫星、包裹一起进行多变量分析,表明cSMARCA5表达水平是OS的独立危险因素,并且cSMARCA5表达水平与甲胎蛋白,肿瘤大小,微血管侵入,包裹一起进行多变量分析,表明cSMARCA5表达水平是RFS的独立危险因素(图4-C,D)。


图4


05

在体内及体外实验中,cSMARCA5抑制HCC的生长及转移

在HCC细胞中过表达cSMARCA5,CCK-8实验、划痕愈合实验和Transwell迁移表明过表达cSMARCA5抑制HCC细胞的生长及迁移(图5-A-C)。裸鼠皮下注射结果表明,过表达cSMARCA5抑制HCC的生长,而原位植入肝内转移模型同样支持此结果(图5-D, E)。进一步通过尾静脉接种建立肺转移模型,结果表明过表达cSMARCA5有效抑制肺转移(图5-F, G)。


图5 


06

cSMARCA5发挥海绵作用吸附miR-17-3p和miR-181b-5p

    为了研究cSMARCA5作用机制,通过RNA免疫沉淀实验,以AGO2抗体下拉捕获到cSMARCA5(图6-A),表明了cSMARCA5作为AGO2和miRNAs的结合平台。作者接着通过软件筛选到29个有可能在HCC中跟cSMARCA5互作的后续miRNA,结合circRNAs 沉淀实验发现了两个高丰度miRNA,为miR-17-3p和miR-181b-5p(图6-B)。通过荧光素报告因子检测实验表明,miR-17-3p或miR-181b-5p与报告基因共转,报告因子活性减低(图6-C);在cSMARCA5序列中突变与miR-17-3p或miR-181b-5p结合的位点后,与报告基因共转,报告因子活性增强(图6-D,E)。pull-down实验也证明了cSMARCA5与miR-17-3p、miR-181b-5p的互作(图6-F),并共定位于细胞质(图6-G,H)。综上所述,cSMARCA5吸附miR-17-3p、miR-181b-5p。


图6


07

cSMARCA5在HCC中通过参与miR-17-3p/miR-181b-5p- TIMP3途径抑制HCC的生长和迁移

    作者通过检测cSMARCA5的过表达及敲除细胞系发现,TIMP3随着cSMARCA5表达水平上调而上升,下调而下降(图7-A, B),同样,在HCC与ANL组织中,TIMP3的表达水平与cSMARCA5表达水平正相关(图7-F, G)。进一步研究发现,当过表达miR-17-3p或miR-181b-5p时,TIMP3表达水平降低,而在此基础上过表达cSMARCA5能恢复TIMP3的水平,CCK-8实验同样证明了此结果(图7-C, D)。Transwell转移实验也证明了miR-17-3p/miR-181b-5p能促进HCC细胞的转移,而cSMARCA5的过表达能打破这种促进作用(图7-E),综上所述,cSMARCA5通过调控miR-17-3p/miR-181b-5-TIMP3途径,从而抑制HCC的生长和迁移。


图7


总结

cSMARCA5可以作为miR-17-3p/miR-181b-5的海绵分子,吸附miR-17-3p/miR-181b-5,从而消除癌症抑制因子TIMP3的抑制作用,但是在HCC中,DHX9的表达水平上调,抑制cSMARCA的表达,导致cSMARCA表达量下降,最终促进HCC的生长和转移。


图8

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