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lncRNA MIR100HG和miR100 以及miR125b在CRC抗cetuximab的调控作用

2018-02-06

lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling

 

来源于lncRNA MIR100HGmiR-100miR-125b通过Wnt/β-连环蛋白信号通路调控结直肠癌的抗西妥昔单抗效果

 

 结直肠癌(colorectal cancer ,CRC)无论是在发病率还是在死亡率中都是最高的三类癌症之一[1],早期结直肠患者没有症状,所以需要通过肠镜和基因筛查的方法去诊断。西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗是表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体,能够结合细胞外EGFR区域增强受体的内吞和降解,一般可化疗药物联用治疗CRC。患者对cetuximab治疗的耐药和KRASNRASBRAFEGFR的基因突变可能有关,文章通过研究lncRNA MIR100HG和其包含的2miRNAmiR-100miR-125b,CRC和头部颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系对cetuximab耐药机制的研究,发现miR-100miR-125b都能下调5个负调控Wnt-β-catenin信号的分子,来促进Wnt信号通路,从而促进癌细胞的耐cetuximab性能。同时发现MIR100HG的表达能促进miR-125b的表达,miR-125b的表达能抑制GATA6的表达,而GATA6的表达又能抑制HIR100HG的表达,而MIR100HG的高表达与CRC病人的耐cetuxima过程有关。该研究为治疗和诊断结直肠癌的耐cetuxima提供一定的参考意义。

补充:约有17.5%miRNA来源于lncRNA,定义为lnc-pri-miRNA,对这种miRNA的转录形成机制感兴趣的童鞋可以看这边文献(Microprocessor mediates transcriptional termination in genes encoding long noncoding microRNAs)

 

 

 

这篇文章的主要研究结果如下

1. 建立了抗cetuximab的肿瘤细胞

1)作者团队选用KRAS/NRAS/BRAF基因未突变的微卫星不稳定的结直肠癌细胞,HCA-7,同时采用3维细胞培养技术来建立抗cetuximabCTX)的结直肠癌细胞团(CC-CR)。一个简单抗CTX细胞系的构建就需要4个月,经历不少于202维细胞培养和3维加药细胞培养的循环,科研果然是寂寞的重复!

 

 

2)成功构建CC-CR后作者又通过一系类的验证来确定CC-CR的确是抗CTX。首先通过DIC(微分干涉对比显微镜)对比CC(对cetuximab敏感的结直肠癌细胞团)和CC-CR的形态差异,发现CC是中空的排列整齐的单细胞团,而CC-CR是实质紊乱的细胞团。其次是用CTX处理CCCC-CR观察其克隆存活数和增殖、凋亡情况,发现CCCTX的存在情况下克隆数大幅度下降、增殖抑制、凋亡细胞明显增多,而CC-CR基本没有差异。最后在动物实验上检测了CC异种移植瘤对CTX敏感,而CC-CR异种移植瘤无惧CTX依然保持着低分化和增殖特性。做科研就要从保持严谨的态度,多方面验证自己的结论,这样才会避免被撤稿危机。


 

 

 


2. 发现在抗cetuximab细胞中MIR100HG和来源于这个lncRNA的两个miR-100miR-15b的表达上调

1) 作者是怎样发现长非编码RNA-MIR100HGmiR-100miR-125b在抗cetuximab 结直肠癌细胞中高表达的呢?当然是我们bob综合体育物擅长做的基因测序!作者将3维培养的CCCC-CR进行全外显子测序和RNA-Seq,没有发现与已知的抗cetuximab相关的基因,但是RNA-Seq发现大量差异表达的转录本。利用miRNA-Seq发现7个上调的miRNA24个下调的miRNA。而且差异表达的转录本中lncRNA MIR100HG是上调最显著的,而差异表达的miRNA中上调最显著的是miR100miR-125b

 


2) 通过QPCR验证了MIR100HGmiR-100miR-125bCC-CR中高表达,同时利用TCGA数据库分析了MIT100HG的表达和miR-100miR-125b的相关性,发现他们的确是有紧密联系。作者还利用FISH发现与CC异种异种移植瘤相比MIR100HGmiR-100miR-125bCC-CR异种移植瘤中富集。并分析其他30CRC细胞系中MIR100HGmiR-100miR-125b的表达情况,发现在抗cetuximab CRC细胞系中MIR100HGmiR-100miR-125b的表达更高。


 

 

3) 作者还在8种头部颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系中检测了MIR100HGmiR-100miR-125b的表达,发现抗cetuximabNHSCC细胞系中MIR100HGmiR-100miR-125b的表达上调。


3. MiR-100miR-125b协同促进细胞的抗cetuximab

作者通过构建miR-100miR-125b的过表达和干扰(sponge)慢病毒,构建稳定表达miR-100miR-125b以及其spongeCCCC-CR细胞系。发现过表达CC或是干扰CC-CRmiR-100对的细胞的抗cetuximab能力没有miR-125b强。作者从3个方面进行了验证:1CTX处理miRNA改变后CCCC-CR检测其克隆的形成,2)检测增殖和凋亡,3)在裸鼠皮下种植异种瘤检测肿瘤大小。3个实验显示CC过表达miRNA后其抗cetuximab能力上升,而CC-CR过表达miRNAsponge后其抗cetuximab的能力下降。作者同时还在其他结直肠癌细胞系和HNSCC细胞系中验证了miR-100miR-125b协同促进细胞的抗cetuximab作用。


 

 

4. MiR-100miR-125b通过抑制多个Wnt负调控因子增加Wnt信号

1) 作者通过分析上面mRNA测序数据发现在CC-CR里下调的基因有Wnt信号通路下调分子(DDK1DDK3),而Wnt的活性在CC-CR里是激活的。作者猜想miR-100miR-125b可能通过Wnt的下调分子来激活Wnt信号。利用生物信息学分析软件和网站作者发现DDK13’UTRs区有miR-100的结合位点,而DDK33’UTRs区有miR-125b的结合为点。作者还分析了Wnt的其他负调控分子ZNRF3RNF43APC2miR-100miR-125b的结合位点。然后通过构建这5个负调控分子的双荧光报告质粒,通过双荧光分析实验确认他们的确有相互作用位点。WB检测了CC过表达miRNA后这5个分子的表达下降和CC-CR干扰miRNA后这5个负调控分子的表达升高。

 


2) 随着Wnt负调控分子的表达降低,Wnt分子激活,在CC-CR中酪氨酸磷酸化的p-Y489β-catenin激活增加而且增加了核β-catenin,同时Wnt靶基因(CCND1KLF4MYCNKD1PROX1S100A4mRNA水平上升。CC过表达miRNAWnt的靶基因mRNA水平也随着上升,在其他结直肠癌细胞同样有这样的现象。

 

 

3) Wnt的负调控分子DDK1DDK3的重组蛋白能恢复部分CC-CRcetuximab的敏感性,使CC-CR的增殖降低、凋亡增加。同时利用Wnt的抑制剂XAV-939ICG-001也能恢复CC-CRcetuximab的敏感性,联合使用cetuximabICG-001能抑制CC-CR异种移植瘤的生长。

 

 

 


综上述,阻断Wnt信号,无论是APC/β-catenin上游还是下游,降解复合物能恢复抗cetuximab细胞的cetuximab的敏感性。

 

5. MIR100HG/miR-125bGATA6是负调控关系

1)作者通过Match program软件分析MIR100HG的转录启动子2.5Kb区域能结合的转录因子,和RNA-seq结果进行比对,发现了转录因子GATA6既能结合MIR100HG的启动子区域又在CC-CR里表达下调。CCcetuximab刺激后GATA6的表达下降,但是用cetuximab处理48hGATA6mRNA水平显著上升;CC里的GATA6敲除后MIR100HG表达上调,而且不再受cetuximab的调控,说明GATA6能有负调控MIR100HG。通过双荧光报告实验发现MIR100HG启动子活性受GATA6抑制,且程剂量依赖。

2) 作者进一步分析了GATA6MIR100HG启动子结合的区域,在MIR100HG启动子区域预测了4GATA结合位点,通过逐步截断和突变发现了GATA-binding site 2GATA6抑制MIR100HG转录活性的主要位点。并通过CHIPEMSA实验来证明GATA6MIR100HGGATA-binding site 2有结合。

 

 

3)通过分析发现GATA63’UTR区域有miR-125b的结合位点,通过双荧光报告系统检测到GATA6的确与miR-125b有结合。在CC里过表达miR-125bGATA6的表达下降;而在CC-CR里干扰miR-125bGATA6的表达上调。作者还在利用TCGA数据分析了CRCGATA6MIR100HG的相关性,发现在IVCRC病人中GATA6是的低表达而MIR100HG是高表达。

 

总之,MIR100HG的转录受转录因子GATA6的抑制,但是miR-125b的高表达能抑制GATA6的表达,而MIT100HG高表达会促进miR-125b的表达,这三者之间形成了一个双反馈调节CC细胞的抗体cetuximab


6.  MIR100HGmiR100miR125b在发展为抗cetuximab的结直肠癌中表达上调

作者最后利用临床数据分析了CRC病人在用cetuximab过程中miR-100miR-125b等研究分子的改变,发现在cetuximab治疗后miR-100miR-125b和核β-catenin的表达上调。GATA6与前期研究结果相反,在cetuximab治疗后同样是表达升高,且无论是miR-125bGATA6还是miR-100GATA6都没有负相关性。利用FISH检测CRC组织里miR-100miR-125bMIR100HGβ-cateninGATA6的表达,发现与前期研究一致,都是在cetuximab治疗后miR-100miR-125bMIR100HGβ-catenin的表达上升,而GATA6的表达下降。    

 

 

 

作者没有详细解释为啥出现GATA6miR-125b的关系在统计10CRC病人经过cetuximab治疗后表达没有成负相关结果。但是作者诚实的将这个结果呈现在文献里,说明出现相反的结果可以不用怀疑自己的结果,可能那就是真实的结果,要学会接受。

 

最后用一张作者补充数据的图来解释全部研究分子之间的关系:作者发现了非编码RNA MIR100HG以及其编码的2miRNA参与调控Wnt信号通路激活引起的抗cetuximab效应。

从这篇文章得到的启发:

1. 研究lncRNAlncRNA编码的miRNA也是一个很好的切入点

2. LncRNA的调控上游的寻找除了可变剪接,其转录调控涉及的转录因子也是可以大做文章的

3. 癌症的抗药性也是一个很好的研究点,前提是你有足够时间和经费。

4. 出现相反结果要接受,说不定编辑能接受矛盾结果,不过能合理解释最好了。

 


References:

[1] R. L. Siegel, K. D. MillerA. Jemal, Cancer Statistics, 2017, CA Cancer J Clin, 1(67), 7-30, (2017)

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